2-4-1. فارماکوکینتیک دارو35
2-4-2. مکانیسم اثر دارو35
2-4-3. موارد مصرف دارو36
2-4-4. منع مصرف و احتیاط36
2-4-5. عوارض جانبی36
2-4-6. تداخلات36
2-4-7- دوز مصرفی36
2-5. اهمیت اندازه‌گیری رالوکسیفن37
فصل سوم: مواد و روش ها
3-1. مواد شیمیایی و تجهیزات دستگاهی39
3-1-1. مواد شیمیایی، استانداردها و نمونه‌های حقیقی39
3-1-2. تجهیزات دستگاهی39
3-2. روش استخراج40
3-2-1. استخراج به اختصار طی مراحل زیر انجام گرفت:41
3-2-2. مراحل بهینه‌سازی42
3-2-2-1. بهینه‌سازی شرایط جداسازی42
3-2-2-2. بهینه‌سازی شرایط استخراج42
3-2-2-2-1. نوع حلال آلی43
3-2-2-2-2. اثر pH فاز دهنده43
3-2-2-2-3. اثر pH فاز گیرنده43
3-2-2-2-4. اثر قدرت یونی فاز دهنده43
3-2-2-2-5. اثر همزدن محلول آنالیت43
3-2-2-2-6. اثر زمان استخراج43
3-2-2-2-7. اثر دما بر استخراج43
3-2-3. ارزیابی کارایی روش استخراج44
3-2-3-1. منحنی درجه‌بندی44
3-2-3-2. تعیین فاکتور پیش تغلیظ (PF)44
3-2-3-3. تعیین تکرارپذیری (RSD)45
3-2-4. آنالیز نمونه حقیقی45
فصل چهارم: نتایج
4-1. میکرواستخراج سه فازی بر پایه استفاده از فیبر توخالی متخلخل47
4-1-1. اصول تئوری47
4-2. مراحل بهینه‌سازی50
4-2-1. بهینه‌سازی شرایط جداسازی50
4-2-2. بهینه‌سازی شرایط استخراج51
4-2-2-1. نوع حلال آلی51
4-2-2-2. اثر pH فاز گیرنده و فاز دهنده53
4-2-2-3. اثر سرعت هم‌زدن محلول آنالیت55
4-2-2-4. اثر قدرت یونی فاز دهنده57
4-2-2-5. اثر زمان استخراج58
4-2-2-6. اثر دمای استخراج59
4-3. تعیین پارامترهای تجزیه‌ای روش استخراج60
4-3-1. تهیه منحنی درجه‌بندی61
4-3-2. فاکتور پیش تغلیظ (PF) و درصد بازیابی (R%)61
4-3-3. تعیین حد تشخیص (LOD)63
4-3-4. تکرارپذیری روش (RSD)63
4-4- آنالیز نمونه حقیقی64
فصل پنجم: بحث و نتیجه‌گیری
5-1. مقایسه روش استخراجی با روش‌های گزارش شده‌ی دیگر مراجع66
5-2. نتیجه‌گیری69
منابع…………………………………………………………………………………………………………………………………70
خلاصه انگلیسی…………………………………………………………………………………………………………………83
ضمائم………………………………………………………………………………………………………………………………..84
عنوان فهرست جداول صفحه
جدول 1-2: کاربردهای کروماتوگرافی تقسیمی ……………………………………………………………………………………………23
جدول 2-2: کاربردهای اخیر HF-LPME در استخراج ……………………………………………………………………………33
جدول 4-1: خلاصه نتایج بهینه سازی فرآیند استخراج ……………………………………………………………………………….59
جدول 4-2: ارقام شایستگی HF-LPME داروی رالوکسیفن …………………………………………………………………….63
جدول 4-3: نتایج اندازه گیری رالوکسیفن در پلاسما …………………………………………………………………………………..65
جدول 5-1: کارهای انجام شده بر روی رالوکسیفن ………………………………………………………………………………………67
عنوان فهرست نمودارها صفحه
نمودار 4-1: بررسی نوع حلال آلی پرکننده منافذ فیبر توخالی ……………………………………………………………………53
نمودار 4-2: بررسی تغییرات pH فاز دهنده درفرآیند استخراج …………………………………………………………………..54
نمودار 4-3: بررسی تغییرات pH فاز گیرنده درفرآیند استخراج ………………………………………………………………….55
نمودار 4-4: اثر سرعت همزدن بر فرآیند استخراج ……………………………………………………………………………………….56
نمودار 4-5: تاثیر قدرت یونی فاز دهنده بر فرآیند استخراج ………………………………………………………………………..57
نمودار 4-6: تاثیر زمان برفرآیند استخراج ……………………………………………………………………………………………………..58
نمودار 4-7: تاثیر دما برفرآیند استخراج ………………………………………………………………………………………………………..59
نمودار 4-8: منحنی درجه بندی نمونه در محیط آبی ………………………………………………………………………………….60
نمودار 4-9: منحنی درجه بندی نمونه در تزریق مستقیم …………………………………………………………………………….62

عنوان فهرست اشکال صفحه
شکل 1-1: روش های مختلف استخراج و میکرو استخراج ……………………………………………………………………………..4
شکل 2-1: نمای جانبی از سیستم میکرواستخراج با حلال با استفاده از میله تفلنی …………………………………….9
شکل 2-2: نمایی از سیستم میکرو استخراج با تک قطره …………………………………………………………………………….11
شکل 2-3: اصول استخراج HF-LPME …………………………………………………………………………………………………….13
شکل 2-4: سیستم HF-LPME براساس پیکربندی U شکل و میله ای …………………………………………………16
شکل 2-5: طرح شماتیک از سیستم HF-LPME …………………………………………………………………………………….17
شکل 2-6: شمایی از سیستم HF-LPME و سیستم نیمه خودکار ………………………………………………………….17
شکل 2-7: طرح شماتیک میکرواستخراج فاز مایع ……………………………………………………………………………………….20
شکل 2-8: شمایی از دستگاه HPLC ………………………………………………………………………………………………………….25
شکل 2-9: یک حلقه نمونه برداری کروماتوگرافی مایع ………………………………………………………………………………..27
شکل 2-10: نسلول آشکارساز فرابنفش برای HPLC ………………………………………………………………………………..31
شکل 2-11: ساختار شیمیایی مولکول رالوکسیفن …………………………………………………………………………………..35
شکل 3-1: تصویر سیستم استخراج استفاده شده در آزمایشگاه …………………………………………………………………..42
شکل 4-1: کروماتوگرام تزریق محلول آبی رالوکسیفن در شرایط بهینه استخراج …………………………………..51
شکل 4-2: کروماتوگرام های نمونه پلاسما ……………………………………………………………………………………………………64
خلاصه فارسی
رالوکسیفن برای درمان سرطان پستان و نازایی وابسته به‌اولیگومنوره یا آمنوره ثانویه مصرف‌ می‌شود. رالوکسیفن درمان جدیدی است که اخیراً برای پیشگیری از پوکی استخوان ستون فقرات در دسترس قرار گرفته است. این دارو به صورت روزی یک قرص مصرف می‌گردد. از بعضی جهات این دارو شبیه استروژن عمل می‌کند، اما برخلاف آن باعث خونریزی از مهبل یا افزایش خطر ابتلاء به سرطان پستان نمیشود.
در واقع شواهدی وجود دارد که این دارو خانمها را از ابتلاء به سرطان پستان در حداقل سه سال اول شروع درمان محافظت می‌کند. رالوکسیفن در برطرف کردن مشکلات یائسگی خانمها مثل برافروختگی، احساس داغ شدن و عرق ریزش شبانه کمکی نمی‌کند.
مکانیسم اثر: رالوکسیفن از گروه داروهای SERM(تعدیل کننده های انتخابی گیرنده استروژن) می باشد. این داروها در برخی بافت ها اثرات مشابه استروژن ( آگونیستی)، و در سایر بافت ها دارای اثرات مشابه نسبی و یا جلوگیری از اثر استروژن (آنتاگونیستی) دارند. رالوکسیفن در درمان سرطان های پاسخ دهنده به هورمون تجویز می شود و در این بافت به عنوان آنتاگونیست از فعال شدن گیرنده توسط استروژن های آندوژن جلوگیری می کند.
عوارض جانبی: گر گرفتگی، خونریزی واژن، توقف قاعدگی، خارش فرج، اختلالات گوارشی، التهاب تومور، کاهش تعداد پلاکتها، احتباس مایعات، طاسی، فیبروم رحم، اختلالات بینایی (تغییرات قرنیه، آب مروارید و رتینوپاتی‌) کاهش پلاکت‌ها یا گلبول‌های سفید خون، به‌ندرت کاهش نوتروفیل‌ها و تغییرات آنزیم‌های‌کبدی از عوارض جانبی دارو هستند.
در این مطالعه یک روش میکرواستخراج فاز مایع با استفاده از فیبر توخالی به همراه کروماتوگرافی مایع با عملکرد بالا (HPLC) و دتکتور UV جهت پیش تغلیظ و شناسایی رالوکسیفن در پلاسما به کار برده شد. رالوکسیفن از 15 میلی‌لیتر محلول بازی نمـونـه بـا 11= pH بـه داخـل یـک حـلال آلـی( اکتانول) که در منافذ دیواره فیبر قرار داشت استخراج شد. به دنبال آن این دارو از حلال آلی به داخل فاز گیرنده آب با ماهیت اسیدی با 5/2pH= که در داخل فیبر قرار داشت وارد شد. در ادامه فاکتورهای موثر در میکرواستخراج که شامل pH فاز دهنده و فاز گیرنده، نوع حلال آلی، قدرت یونی فاز دهنده، زمان استخراج سرعت هم‌زدن بررسی و بهینه شد. پس از استخراج دارو با شرایط بهینه فاکتور پیش تغلیظ 108درصد بازیابی 81 درصد حد تشخیص 3/0 نانوگرم بر میلی لیتر، محدود خطی بودنng/ mL 100-1 با 99/0R2= و %35/3 RSD = حاصل شد.
کلید واژه: میکرواستخراج، هالوفایبر، پیش تغلیظ، فیبر توخالی، رالوکسیفن.
مقدمه
علم شیمی تجزیه روش‌های متنوعی را برای آنالیز کمی و کیفی مواد ارائه می‌دهد. امروزه روش‌های جداسازی، تفکیک گونه‌ای موجود در بافت‌های پیچیده را با حد تشخیصی در حد خیلی کم (فمتوگرم) مقدور ساخته است. علاوه بر روش‌های جداسازی، مرحله‌ی آماده‌سازی نمونه نیز یکی از مهم‌ترین مراحل در روند تجزیه می‌باشد. این مرحله شامل تبدیل بافت یک نمونه حقیقی به حالتی است که برای تجزیه با یک تکنیک جداسازی و یا روش‌های دیگر مناسب باشد. می‌توان گفت مرحله آماده‌سازی نمونه برای اهداف زیر طراحی شده است:
1- حذف مزاحمت‌ها از نمونه به منظور افزایش گزینش‌پذیری روش
2- پیش تغلیظ آنالیت مورد نظر و افزایش غلظت آن به نحوی که بتوان آنرا با دستگاه‌های تجزیه‌ای اندازه‌گیری کرد.
3- تبدیل آنالیت‌ها به فرمی که برای شناسایی با دستگاه تجزیه‌ای مناسب باشد.
اساسی‌ترین روش آماده‌سازی نمونه، روش استخراج است. تلاش متخصصین شیمی تجزیه برای ابداع و توسعه‌ی روش‌های اندازه‌گیری با دقت و صحت بالا و نیز حذف مراحل دستی که موجب تکرارپذیری پایین در روش‌های تجزیه‌ای می‌شود، باعث شده که روش‌های استخراجی نوینی ابداع گردد. شکل (1-1) روش‌های مختلف استخراج و میکرواستخراج را دسته‌بندی می‌کند که راجع به آنها توضیحات مفصلی در مراجع آمده است.
در کلیات به اختصار راجع به میکرواستخراج مایع- مایع با قطره روش‌های استخراج بر پایه استفاده از فیبرهای توخالی متخلخل بحث خواهد شد.
شکل (1-1). روش‌های مختلف استخراج و میکرواستخراج
فصل اول
کلیات

در این سایت فقط تکه هایی از این مطلب با شماره بندی انتهای صفحه درج می شود که ممکن است هنگام انتقال از فایل ورد به داخل سایت کلمات به هم بریزد یا شکل ها درج نشود

شما می توانید تکه های دیگری از این مطلب را با جستجو در همین سایت بخوانید

ولی برای دانلود فایل اصلی با فرمت ورد حاوی تمامی قسمت ها با منابع کامل

اینجا کلیک کنید

1-1. بیان مساله
جهت اندازه‌گیری مقادیر Trace رالوکسیفن در مایعات بدن می‌بایست از متدی استفاده شود که به تیم پزشکی در تنظیم دوز دارو بدون نیاز به خون‌گیری و از طریق غیر تهاجمی کمک کند و قدرت شناسایی و تفکیک این دارو را داشته باشد. با استفاده از متد پیش تغلیظ دارو با میکرواستخراج فاز مایع به کمک هالوفایبر می‌توان مقادیر بسیار کم این دارو را در پلاسما تغلیظ و استخراج نمود، سپس با دستگاه HPLC اندازه‌گیری کرد. از آنجا که دفع این دارو کبدی است و فقط 6 درصد از راه ادرار دفع میشود در افراد با نارسایی کبدی دوز دارو 2.5 برابر میشود در افراد با نارسایی کلیوی کلیرانس 15 درصد افزایش می یابد و با توجه به نیمه عمر آن، می‌توان از نمونه پلاسما افراد جهت آنالیز استفاده نمود. این روش بسیار جدید بوده و تا به حال جهت پیش تغلیظ و اندازه‌گیری این دارو استفاده نشده است.
1-2. اهداف
ابداع روش جدید و غیر تهاجمی (non invasive) جهت تعیین مقدار این دارو از طریق بهینه‌سازی پارامترهای موثر در پیش تغلیظ و اندازه‌گیری این دارو و در نهایت دستیابی به دوز تجویزی مناسب در کسانی که دارو را دریافت می‌کنند.

فصل دوم
بررسی متون و مطالعات دیگران در این زمینه
2-1. مروری بر روش‌های استخراج مایع- مایع و میکرواستخراج مایع- مایع1
استخراج مایع- مایع بر مبنای توزیع گونه بین دو فاز امتزاج‌ناپذیر که معمولاً یکی از آن‌ها آب و دیگری یک حلال آلی است استوار است. در این روش اساس جداسازی توزیع است ]12[.
عوامل موثر در استخراج مایع- مایع عبارتند از:
نوع حلال استخراج کننده، حجم حلال آلی برای استخراج، pH، عامل استخراج، عامل پوشاننده و قدرت یونی محیط.
استخراج مایع- مایع یکی از قدیمی‌ترین روش‌های جداسازی است، سادگی و کاربردی بودن در مقیاس تجزیه‌ای و صنعتی از عوامل بقای این روش تا امروزه بوده است. از مهم‌ترین معایب این روش مصرف زیاد حلال آلی و آلودگی محیط زیست، هزینه حلال آلی و ایجاد سمیت می‌باشد. در همین راستا با پیشرفتی که در این روش صورت گرفت و با کم کردن مقدار حلال آلی استخراجی، روش‌های میکرواستخراج با حلال روی کار آمدند که در این روش‌ها حجم حلال آلی مصرفی به مقدار قابل توجهی کاهش می‌یابد ]29[.
روش‌های میکرواستخراج با حلال شامل موارد زیر می‌باشد:
میکرواستخراج فاز مایع با تک قطره2 (SDME)
میکرواستخراج فاز مایع توسط غشای فیبر توخالی3(HF-LPME)
میکرواستخراج فاز مایع با استفاده از انجماد حلال استخراج کننده
میکرواستخراج فاز مایع- مایع پخشی4 (DLPME)
2-1-1. میکرواستخراج فاز مایع
2-1-1-1. میکرواستخراج فاز مایع با تک قطره
Liu و Dasgupta اولین محققانی بودند که از یک قطره‌ی کوچک جهت تغلیظ و استخراج استفاده نمودند. آنها با به کار بردن یک میکرو قطره‌ی آلی از جنس کلروفرم به صورت معلق در یک قطره آبی در حال جریان (سیستم قطره در قطره) توانستند سدیم دو دسیل سولفات را به صورت زوج یون با متیلن بلو به داخل کلروفرم استخراج نماید ]12[. تقریباً در همان زمان jeannot و cantwell روشی را معرفی کردند که آن میکرواستخراج با حلال نامیدند ]37[. در این روش یک قطره 8 میکرولیتری از حلال آلی n- اکتان حاوی مقدار ثابتی از استاندارد داخلی در انتهای میله‌ی تفلونی قرار می‌گرفت و میله‌ی تفلونی به محلول آبی در حال چرخش که حاوی آنالیت بود وارد می‌شد. بعد از اتمام استخراج، میله تفلونی از محلول آبی بیرون کشیده شده و 1 از فاز آلی برای آنالیز به دستگاه کروماتوگرافی گازی تزریق می‌گردید (شکل 2-1).
شکل (2-1). نمای جانبی از سیستم میکرواستخراج با حلال با استفاده از میله‌ی تفلونی
در سال 1997 به موازات تحقیقات Jeannot و Cantwell روی میکرواستخراج با قطره He ]44[ و Lee استخراج با قطره را در حالت استاتیک و دینامیک انجام دادند. در روش استاتیک، یک میکرولیتر از قطره‌ی استخراجی در نوک سوزن میکروسرنگ معلق شده، در تماس با محلول آبی قرار گرفته و استخراج گونه از فاز آبی به داخل قطره انجام می‌گیرد. در روش دینامیک، پیستون میکروسرنگ به صورت قیف جدا کننده عمل می‌نماید. با کشیدن پیستون و ورود محلول آبی به داخل میکروسرنگ، لایه‌ی نازکی از فاز آلی در جدار داخلی سرنگ و سوزن تشکیل شده و همرفت القاء شده در اثر حرکت پیستون منجر به استخراج گونه‌ها از فاز آبی به لایه آلی می‌گردد ]31[. میکرواستخراج با قطره به دو شیوه دو فازی و سه فازی قابل انجام است. در میکرواستخراج دو فازی، استخراج گونه‌ها به درون یک حلال آلی غیر قابل امتزاج با آب رخ می‌دهد. در میکرواستخراج سه فازی یا میکرواستخراج مایع- مایع- مایع5، گونه‌ها از نمونه به درون حلال آلی و سپس با استخراج برگشتی به درون فاز آبی پذیرنده استخراج می‌شوند.
در میکرواستخراج با قطره (دو فازی یا سه فازی) به دلیل انتقال گونه‌ها از نمونه‌های با حجم چند میلی‌لیتر به داخل میکرو قطره‌ای با حجم میکرولیتر، فاکتور تغلیظ بالایی برای مواد مختلف به دست می‌آید. وجود یک مرحله استخراج برگشتی در سیستم سه فازی، انتخابگری سیستم را بالا می‌برد، چرا که طی آن بسیاری از مولکول‌های خنثی حذف گردیده و روش از قدرت پاکسازی6 بالایی برای نمونه‌های با ماتریس پیچیده برخوردار می‌گردد. با انتخاب حلال آلی مناسب، کاهش نسبت حجم میکرو قطره‌ی پذیرنده به نمونه، تنظیم شرایط و pH فازهای دهنده و گیرنده و نیز با بکارگیری واکنش‌گرهای کمکی در فاز استخراجی به منظور به دام اندازی گونه‌ها، می‌توان کارایی استخراج را افزایش داد ]30[.
قرارگیری حلال استخراجی در معرض بافت پیچیده‌ی نمونه و انحلال جزیی حلال در آب، دشواری نگهداری قطره درون محلول، عدم امکان استفاده از دماهای بالا و ناپایدار شدن قطره طی هم‌زدن محلول، همچنین کشیده شدن مقداری از محلول همراه با قطره به درون میکروسرنگ در انتهای کار از جمله معایب روش SDME می‌باشد. Jeannot و همکارانش در سال 2001 با هدف رفع این محدودیت‌ها ایده‌ی استفاده از قطره‌ی حلال در فضای فوقانی7 را مطرح نمودند ]66[.
در این روش که میکرواستخراج با حلال از فضای فوقانی نامیده می‌شود، قطره برای زمانی معلوم در تماس با فضای فوقانی نمونه قرار گرفته و استخراج گونه‌ها از محلول به فضای فوقانی و از آنجا به درون قطره انجام می‌پذیرد.
HS-SDME روشی ساده، حساس و ارزان است و جهت استخراج ترکیبات فرار و نیمه فرار از نمونه‌های با بافت پیچیده بسیار مناسب می‌باشد ]73، 46[ به منظور افزایش تکرارپذیری استخراج، این روش توسط دستگاه‌های نیمه خودکار و تمام خودکار نیز انجام پذیرفته است. در شکل (2-2) نمایی از سیستم میکرواستخراج با قطره به دو شیوه استخراج مستقیم و استخراج از فضای فوقانی نشان داده شده است.
(شکل 2-2). نمایی از سیستم میکرواستخراج با تک قطره الف) استخراج مستقیم از درون محلول ب) استخراج از فضای فوقانی
2-1-1-2. میکرواستخراج فاز مایع با فیبر توخالی (HF-LPME)
روش LPME با تک قطره به صورت دو فازی و سه فازی از مزایایی همچون مصرف مقادیر بسیار کم از نمونه و حلال آلی، حساسیت و فاکتور تغلیظ بالا، قابلیت انجام به صورت استاتیک و دینامیک و قدرت پاکسازی بسیار مطلوب برای نمونه‌های پیچیده برخوردار است.
مهم‌ترین عیب روش از آنجا ناشی می‌شود که نگه‌داری قطره‌ی استخراجی در انتهای میکروسرنگ بویژه برای زمان‌های طولانی و تحت هم‌زدن شدید محلول دشوار بوده و به شرایط و مهارت خاصی نیازمند است. به منظور غلبه بر مشکلات فوق و نیز استفاده از فازهای گیرنده‌ای با حجم بیشتر Rasmussen و Pedersen-Bjergaard در سال 1999 استفاده از فیبرهای توخالی متخلخل از جنس پلی‌پروپیلن را به عنوان نگهدارنده‌ای جهت حفظ مکانیکی فاز استخراجی پیشنهاد نمودند که تحت عنوان میکرواستخراج فاز مایع با فیبر توخالی نام گرفت ]41، 79[ در واقع تکنیک HF-LPME، نوعی روش میکرواستخراج با غشای مایع نگهداری شده می‌باشد8 که در آن حلال آلی توسط نیروهای کاپیلاری درون منافذ فیبر قرار می‌گیرد و لایه نازکی را نیز روی دیواره‌ی فیبر تشکیل می‌دهد. فاز استخراجی که در حد چند میکرولیتر می‌باشد داخل مجرای درونی فیبر وارد می‌گردد. حجم فاز آلی مورد استفاده در این روش در قیاس با روش سه فازی LPME با قطره کمتر بوده و از سویی امکان تشکیل امولسیون که از مشکلات متداول روش LLE است، حذف می‌گردد.
2-1-1-2-1. اصول استخراج و سیستم‌های مختلف در استفاده از HF-LPME ]53[
شکل (2-3)، اصول روش میکرواستخراج فاز مایع با فیبر توخالی را نشان می‌دهد. محلول آبی نمونه درون یک ظرف کوچک پر می‌شود و تکه‌ای از یک فیبر توخالی از جنس پلی‌پروپیلن متخلخل درون نمونه قرار داده می‌شود. حجم نمونه آلی معمولاً در حد چند میلی‌لیتر و طول فیبر، بسته به نوع کاربرد، در حد چند سانتی‌متر است. پیش از استخراج، فیبر در یک حلال آلی غیر قابل امتزاج با آب آغشته می‌شود تا حلال منافذ فیبر را پر کند. بدین ترتیب، لایه نازکی از حلال آلی در جداره‌ی فیبر، که معمولاً 200 ضخامت دارد، تشکیل می‌شود. حجم کلی حلال آلی تثبیت شده در غشاء معمولاً 20-15 می‌باشد. برای گونه‌های قابل یونیزاسیون، pH محلول به گونه‌ای تنظیم می‌شود که گونه‌ها به شکل غیر یونی خود وجود داشته باشند تا حلالیت‌شان در نمونه آبی کم شود و قابلیت استخراج‌پذیری آنها به درون حلال آلی افزایش یابد. بدین ترتیب، گونه‌های موجود در نمونه‌ی آبی از میان فاز آلی تثبیت شده در غشای فیبر به درون محلول گیرنده موجود در مجرای درونی فیبر استخراج می‌شوند. برای تسریع این فرآیند، هم‌زدن و چرخش سریع نمونه به کار گرفته می‌شود. محلول گیرنده می‌تواند از جنس همان حلال آلی تثبیت شده در منافذ غشای فیبر باشد که در این صورت تشکیل یک سیستم دو فازی را می‌دهد و گونه‌ها در یک فاز آلی استخراج می‌شود ]56، 57[. میکرواستخراج فاز مایع با سیستم دو فازی بیشتر برای گونه‌هایی به کار گرفته می‌شود که حلالیت‌شان در یک حلال آلی غیر قابل امتزاج با آب به میزان قابل توجهی بیشتر از محیط آبی است. در این روش، فاز استخراجی مستقیماً با GC سازگار است، در حالی که برای آنالیز با HPLC یا CE9 به تبخیر حلال و ترکیب دوباره در محیط آبی نیازمند می‌باشد.
شکل (2-3). اصول استخراج HF-LPME (الف) دو فازی (ب) سه فازی
در سیستم سه فازی، محلول گیرنده فاز آبی دیگری است که در آن گونه موجود در نمونه آبی از طریق فیلم نازکی از حلال آلی در غشا به درون محلول آبی پذیرنده استخراج می‌شود. این شیوه استخراجی به گونه‌های بازی و اسیدی با گروه‌های عاملی یونیزه شونده محدود می‌شود. برای استخراج ترکیبات بازی، pH نمونه بایستی در ناحیه قلیایی تنظیم شود تا از حلالیت آنالیت جلوگیری کند. در حالی که pH محلول گیرنده باید پایین باشد تا اینکه حلالیت گونه در آن افزایش یابد. در این صورت گونه‌ها به شکل خنثی وارد فاز آلی شده و مجدداً با تبدیل به شکل یونی به فاز گیرنده، استخراج می‌شوند. در مورد ترکیبات اسید pH فاز دهنده در ناحیه اسیدی و pH فاز گیرنده در ناحیه قلیایی تنظیم می‌شود. در نهایت فاز استخراجی مستقیماً می‌تواند به دستگاه‌های CE، HPLC و یا LC-MS تزریق گردد.
میکرواستخراج فاز مایع با فیبر توخالی به شکل دینامیک هم می‌تواند انجام شود. در سیستم دو فازی، یک میکروسرنگ با چند میکرولیتر از حلال آلی غیر قابل امتزاج با آب پر می‌شود ]81[. تکه کوچکی از فیبر توخالی به سوزن میکروسرنگ متصل شده، فیبر توخالی برای چند ثانیه داخل حلال آلی گذاشته می‌شود تا منافذ فیبر از حلال آلی پر شود. سپس سوزن سرنگ به همراه فیبر در نمونه آبی قرار داده می‌شود و در طول استخراج، حجم‌های کوچکی از نمونه آبی به طور پی در پی به درون فیبر کشیده و خالی می‌شود. در طی کشیدن نمونه آبی به درون سرنگ، فیلم نازک حلال آلی در جداره فیبر شدیداً آنالیت را از محلول نمونه استخراج می‌کند، در حالی که در طی بیرون راندن نمونه، این فیلم نازک دوباره با فاز آلی درون سرنگ ترکیب می‌شود. در طول فرآیند ترکیب شدن دوباره حلال، بخشی از گونه‌ی استخراج شده در طول چرخه، در حلال آلی داخل توده10 فیبر توخالی به دام می‌افتد. پس از استخراج گونه‌ها طی چرخه‌های متوالی، بخشی از حلال آلی موجود در سرنگ برای آنالیز به دستگاه کروماتوگرافی تزریق می‌شود. سیستم سه فازی دینامیک نیز گزارش شده است که البته مشابه روش دو فازی می‌باشد. در این روش، ابتدا میکروسرنگ با چند میکرولیتر از محلول آبی پذیرنده و به دنبال آن با چند میکرولیتر از حلال آلی پـر مـی‌شـود. مابقی فرآیند مشابه روش دو فـازی مـی‌بـاشـد. HF-LPME دینامیک در مقایسه با سیستم‌های استاتیک سرعت استخراج را افزایش می‌دهد، اما در عمل روش دینامیک پیچیده‌تر است و پارامترهای تجربی بیشتری باید کنترل و بهینه شوند ]24، 25[.
علاوه بر دو سیستم HF-LPME اشاره شده که معمولاً براساس گرادیان pH و یا انتقال توسط حامل می‌باشد، اخیراً روش HF-LPME با اعمال یک میدان الکتریکی در دو سمت غشا انجام گرفته و تحت عنوان جداسازی الکتریکی غشا11نام گرفته است. در این روش، نیروی محرک برای استخراج گونه‌ها اختلاف پتانسیل است و گرادیان pH نقشی در استخراج ندارد ]75[.
در تحقیقاتی که توسط Lee انجام گرفت، وی روش جدیدی را بر مبنای فیبر توخالی به نام میکرواستخراج سه فازی مایع- گاز- مایع12 ابداع نمود. در این روش گونه‌ها در اثر حرارت از محلول به جداره فیبر پر شده با هوا نفوذ کرده و سپس به دلیل pH خاص فاز گیرنده، در شکل یونی خود به درون فاز گیرنده استخراج می‌شوند. مزیت این روش این است که هیچ گونه حلال آلی در آن استفاده نمی‌شود.

2-1-1-2-2. جنبه‌های عملی و پیکربندی‌های مختلف HF-LPME
تا کنون اغلب کاربردهای HF-LPME بر اساس فیبرهای پلی‌پروپیلن بوده است، ولی استفاده از فیبر متخلخل پلی‌وینیلیدین دی‌فلوئوراید13 هم گزارش شده است. دلیل این امر، سازگاری بیشتر پلی‌پروپیلن با گستره وسیعی از حلال‌های آلی بوده است. به علاوه، پلی‌پروپیلن با اندازه‌ی منافذ تقریباً 2/0 به خوبی می‌تواند حلال‌های آلی در فیبر در فرآیند LPME تثبیت کند، که این موضوع برای جلوگیری از نشت حلال به درون نمونه مهم می‌باشد. این مساله مخصوصاً در مورد محلول‌هایی که به شدت هم‌زده می‌شوند و نمونه‌هایی مانند پلاسما که با حلال تشکیل امولسیون می‌دهند، دارای اهمیت است. قطر درونی فیبرهای مورد استفاده معمولاً در محدود1200-600 می‌باشد، ولی گزارشاتی نیز در زمینه استفاده از فیبرهای توخالی با قطر درونی کمتر، تا حد 280 وجود دارد. در گزینش فیبر باید ضخامت دیواره آن زیاد نباشد تا فاصله انتشار در فیبر کوتاه بوده و سرعت استخراج افزایش یابد. فیبرهای با ضخامت دیواره‌ی خیلی کم استحکام فیزیکی کافی ندارند و در مقابل استفاده از فیبرهای با ضخامت بیشتر نیز به دلیل افزایش حجم و ضخامت لایه‌ی آلی، منجر به زمان‌های استخراج طولانی‌تر و کاهش کارایی سیستم می‌شود. از این رو معمولاً ضخامت دیواره‌ی 200 برای این منظور مناسب است. در اکثر موارد از فیبری با جنس پلی‌پروپیلن با قطر درونی 600، ضخامت دیواره‌ی 200 و اندازه منافذ 2/0 استفاده می‌شود ]25، 79[.
در کار عملی با فیبر توخالی پیکربندی‌های14 مختلفی از HF-LPME به کار می‌رود. اولین کار در زمینه میکرواستخراج با فیبر توخالی با پیکربندی فیبر به صورت U شکل، توسط Rasmussen و Pedersen-Bjergaard معرفی گردید ]79[. در این تحقیق، قطعات 5/8 سانتی‌متر از فیبر توخالی پلی‌پروپیلنی با قطر داخلی 600، ضخامت دیواره‌ی 200 و اندازه منافذ 2/0 برای استخراج بریده و استفاده شده‌اند. هر انتهای فیبر به یک سوزن میکروسرنگ متصل شد که یکی از این سرنگ‌ها برای ورود فاز گیرنده و دیگری برای کشیدن فاز گیرنده در انتهای استخراج به کار گرفته شد. برای خروج فاز گیرنده یک فشار فوقانی کوچک روی سوزن اول اعمال می‌شود و جمع‌آوری فاز گیرنده از لوله خروجی صورت می‌گیرد ]79[. در پیکربندی U شکل کارایی استخراج مناسب است، ولی در مقابل روش انتقال فاز گیرنده و خودکار کردن15 سیستم مشکل می‌باشد ]79[. برای رفع این مشکل، پیکربندی میله‌ای توسط Rasmussen و Pedersen-Bjergaard و سپس Andrews, Kramer ]33[ پیشنهاد گردید. شکل (2-4) پیکربندی U شکل و میله‌ای را نشان می‌دهد. در پیکربندی میله‌ای به منظور تسهیل در ورود و خروج میکروسرنگ، قطعه‌ای مخروطی به نوک فیبر متصل می‌شود که امکان ورود و خروج فاز استخراجی را توسط میکروسرنگ ساده‌تر می‌سازد. این تکنیک قابلیت سازگاری بیشتری با نمونه‌برداری خودکار دارا می‌باشد.

شکل (2-4). (الف) سیستم HF-LPME براساس پیکربندی U شکل ]79[ (ب) پیکربندی میله‌ای ]77[
به دنبال آن، تکنیک دیگری توسط Muller و همکارانش ارائه شد که در این تکنیک به یک انتهای فیبر وسیله‌ای قیف مانند که از جنس فولاد زنگ نزن متصل می‌شود که محل تزریق است. یک پیچ کوچک در محل تزریق برای نگهداری انتهای باز فیبر به کار گرفته می‌شود و تنها از یک میکروسرنگ برای ورود و خروج فاز گیرنده استفاده می‌شود. باز بودن بخش انتهایی فیبر، مشکلاتی مانند ایجاد حباب هوا طی کشیدن فاز گیرنده را رفع می‌کند. در پایان، پس از استخراج یک نمونه‌بردار خودکار می‌تواند فاز استخراجی را به دستگاه GC تزریق کند.
اخیراً پیکربندی ساده‌تری ارائه گردیده که شامل اتصال مستقیم فیبر به نوک سوزن میکروسرنگ می‌باشد (2-5). در این تکنیک، طول مشخصی از فیبر پس از بسته شدن انتهای آن با حرارت، به سوزن میکروسرنگ که حاوی محلول استخراجی است، متصل شده و پس از آغشته نمودن جدار فیبر با حلال آلی و تزریق محلول استخراجی به داخل فیبر، محلول استخراج کننده به داخل میکروسرنگ کشیده و سپس به دستگاه کروماتوگرافی تزریق می‌شود. شمای این سیستم در شکل (2-5) نشان داده شده است.

شکل (2-5). طرح شماتیک از سیستم HF-LPME
این پیکربندی بدون بستن انتهای فیبر جهت انجام استخراج به صورت دینامیک به کار گرفته شده که در آن یک پمپ سرنگی به طور خودکار پیستون میکروسرنگ را بالا و پایین می‌کشد تا استخراج انجام شود ]57[.
قابل ذکر است که کاربرد فیبر توخالی برای استخراج از حجم زیادی از نمونه در حد 1 لیتر (180) و نیز کاربرد آن به صورت نیمه خودکار نیز عملی شده است، به طوری که در آنها یک یا دو مرحله‌ی استخراج می‌تواند به صورت خودکار انجام گیرد. شکل (2-6) استخراج از حجم بالای نمونه و همچنین سیستم نیمه خودکار استخراجی را نشان می‌دهد.

شکل (2-6). (الف) شمایی از سیستم HF-LPME از حجم زیاد و (ب) سیستم نیمه خودکار
با پیشرفت‌های سریع در این زمینه pawliszyn و همکارانش در سال 2006 موفق به معرفی سیستم تمام خودکار HF-LPME شدند.
2-1-1-2-3. میکرواستخراج فاز مایع از فضای فوقانی با فیبر توخالی
نمونه‌برداری از فضای فوقانی روش موفقی برای استخراج ترکیبات فرار و نیمه فرار از نمونه‌های پیچیده است، به طوری که در آن گونه‌ها ابتدا از نمونه جامد یا مایع خود به فضای فوقانی نمونه انتقال می‌یابند، سپس نمونه‌برداری و اندازه‌گیری انجام می‌گیرد. بدیهی است که گونه‌هایی به این روش قابل اندازه‌گیری هستند که فراریت لازم جهت انتقال به فضای فوقانی را داشته باشند. روش‌های نمونه‌برداری از فضای فوقانی دارای حساسیت کمی هستند، مگر اینکه روش‌های مختلف میکرواستخراج از فضای فوقانی انجام گیرد. در این روش‌ها گونه‌های خارج شده از بافت نمونه، ابتدا به فضای فوقانی نمونه وارد و سپس توسط یک فاز استخراجی جذب و تغلیظ می‌شوند. در نهایت گونه‌ها به دستگاه اندازه‌گیری تزریق می‌شوند. تغلیظ انجام شده باعث دستیابی به حساسیت‌های بالا شده و اندازه‌گیری مقادیر بسیار کم گونه‌های مختلف را امکان‌پذیر می‌سازد.
روش‌های میکرواستخراج از فضای فوقانی به کار رفته تا کنون بر مبنای دو روش فاز جامد و قطره بوده‌اند. در روش میکرواستخراج با فاز جامد از فضای فوقانی، نمونه حاوی گونه‌های مختلف در ظرف در بسته‌ای قرار داده می‌شود و از فیبری با پوشش‌ها و جاذب‌های مختلف برای استخراج و تغلیظ نمونه استفاده می‌شود. پس از گذشت مدت زمان لازم و به تعادل رسیدن سیستم، فیبر جاذب به منظور آنالیز به دستگاه‌های اندازه‌گیری معرفی می‌گردد. این روش دارای معایبی چون، قیمت نسبتاً بالای فیبرهای فاز جامد، محدودیت در انواع پوشش فیبرها، محدود بودن طول عمر فیبرها و اثرات حافظه می‌باشد ]4[.
اما در روش میکرواستخراج با قطره، چند میکرولیتر از یک حلال آلی از انتهای سوزن یک میکروسرنگ در فضای فوقانی یک ظرف در بسته حاوی محلول نمونه در حال هم‌زدن به طور معلق نگهداشته می‌شود. پس از گذشت مدت زمان مشخص و انتقال مقداری از آنالیت‌ها به فاز آلی، حلال به داخل سرنگ کشیده شده و به سیستم اندازه‌گیری تزریق می‌شود. این تکنیک، ساده، سریع، ارزان و بسیار حساس است و تنها با استفاده از یک میکروسرنگ، مراحل مختلف استخراج، تغلیظ و تزریق به سیستم اندازه‌گیری قابل انجام است. علاوه بر این به دلیل عدم تماس مستقیم حلال استخراج کننده با بافت نمونه، مزاحمت‌های ناشی از آلودگی حلال استخراج کننده توسط بافت نمونه رفع شده است. از طرفی در این روش می‌توان از حلال‌های استخراج کننده قابل امتزاج با آب نیز استفاده کرد. از محدودیت‌های این روش تبخیر حلال استخراج کننده با گذر زمان می‌باشد که مانع از افزایش زمان و استخراج و همچنین دمای محلول می‌شود

که این مشکل را می‌توان با سرد کردن سوزن میکروسرنگ که منجر به سرد شدن میکرو قطره می‌شود تا حدودی رفع کرد. البته این روش دارای مشکلاتی نظیر عدم استفاده از حجم‌های بیشتر قطره به دلیل افتادن قطره و مساحت سطح کوچک قطره می‌باشد که منجر به کاهش کارایی استخراج می‌گردد. به دنبال تحقیقات صورت گرفته روی HF-LPME که همگی براساس استخراج مستقیم از محلول نمونه می‌باشد. Jiang یک روش جدید از آنالیز فضای فوقانی بر مبنای HF-LPME را معرفی کردند. این تکنیک مشابه با روش استفاده شده در HF-LPME می‌باشد، با این تفاوت که فیبر توخالی در فضای فوقانی محلول نمونه قرار می‌گیرد. بدین ترتیب مزاحمت‌های ناشی از بافت پیچیده نمونه برطرف می‌شود. از طرفی به دلیل اینکه فاز استخراجی درون فیبر توخالی قرار گرفته، مشکل افتادن حلال استخراجی در اینجا رفع شده است و می‌توان از حجم‌های بیشتر نیز استفاده نمود. علاوه بر این دلیل افزایش مساحت سطح تماس حلال استخراجی و فضای فوقانی، استخراج‌ها سریع‌تر و با کارایی بیشتری قابل انجام است. همچنین به دلیل ارزان بودن فیبر توخالی، می‌توان از هر فیبر یک بار برای استخراج استفاده نمود. بنابراین مشکلات اثرات حافظه، موجود در روش فاز جامد، در این روش وجود نخواهد داشت. از محدودیت این روش می‌توان به تبخیر و از دست رفتن حلال استخراجی طی فرایند استخراج اشاره کرد، که این مشکل نیز با سرد کردن حلال استخراجی قابل رفع است. شماتیک میکرواستخراج فاز مایع فیبر توخالی به دو روش مستقیم و فضای فوقانی در شکل (2-7) نشان داده شده است.
شکل (2-7). طرح شماتیک میکرواستخراج فاز مایع به روش (الف) مستقیم و (ب) فضای فوقانی

دسته بندی : پایان نامه ها

پاسخ دهید